A cada dia aumenta mais o número de piscicultores que produzem seus próprios alevinos, utilizando dessa forma vários hormônios para propagar artificialmente seus peixes. Há muito que a Panorama da AQUICULTURA desejava oferecer a esses produtores um artigo abrangente sobre esse assunto, escrito pelas mãos de Geraldo Bernardino e Rossana Venturieri, dois "cobras" na reprodução de peixes. Finalmente chegou esse momento e esperamos que os leitores possam desfrutar dos conhecimentos aqui publicados e entender melhor o que se passa por detrás da simples injeção dessas substâncias.
Por: Rossana Venturieri - Bolsista/CNPq - e-mail: rventurieri@uol.com.br
Geraldo Bernardino - CEPTA/IBAMA - e-mail: bernard@cepta.ibama.gov.br
Os peixes são animais que têm uma capacidade incrível de adaptação, o que lhes permite colonizar os mais diferentes habitats; esta plasticidade se reflete nas suas mais variadas estratégias, principalmente de alimentação e reprodução. O animal desenvolve mecanismos que lhe permitem tirar o máximo de vantagens do ambiente que dispõe. Realizam migrações, constroem ninhos, incubam ovos e protegem os filhotes, entre inúmeras outras particularidades. A reprodução é a fase mais importante na vida do animal, pois através dela ele garante a manutenção da sua espécie. É um processo fisiológico mediado pela complexa atuação de eventos neurohormonais que, desencadeados por estímulos ambientais, provocam no peixe reações especificas que culminam com a desova.
A prática de indução à desova que fazemos nas pisciculturas é extremamente simples e nos leva a crer que a reprodução também é, bastando injetar e esperar a hora da desova. Mas não é assim que acontece. Para entender um pouco mais o que é que estamos fazendo quando injetamos hormônios ou hipófises nos peixes, é preciso rever alguns aspectos básicos da fisiologia da reprodução. Esse entendimento nos auxiliará na na melhor escolha do hormônio que será aplicado, qual o custo/benefício e o que podemos esperar como resultado.
Controle endócrino da reprodução
Apesar da distância filogenética entre humanos e peixes, através da figura ao lado podemos observar que órgãos endócrinos muito semelhantes estão presentes, embora um ou outro possa ser mais específico (como os corpúsculos de Stannius e sistema neurosecretor caudal em peixes e a paratiróide em humanos). Esta similaridade nos conduz a olhar com mais atenção o animal sob o ponto de vista do seu sistema endócrino, em especial para a reprodução.
A reprodução em peixes pode ser vista como o resultado de numerosos fatores bióticos e abióticos que exercem efeitos, tanto de longo prazo sobre o crescimento ovariano, quanto de curto prazo sobre a maturação final e ovulação dos oócitos. Uma resposta temporalmente adequada a sinais exógenos (como temperatura, fotoperíodo, chuvas etc.) e endógenos maximizam o sucesso reprodutivo, pela obtenção de um equilíbrio ótimo entre a sobrevivência dos adultos que estão desovando e a sua progênie. Obviamente, o custo de um esforço reprodutivo temporalmente inapropriado varia bastante com a estratégia reprodutiva, sendo maior naquelas espécies que ovulam uma única vez e morrem a seguir, como o salmão do pacífico e, consideravelmente menor em reprodutores parciais, que ovulam muitas vezes sobre um extenso período de desova, como as tilápias, por exemplo.
Os peixes de piracema têm uma estratégia intermediária, mas que também demanda em considerável esforço. Eles passam grande parte do ciclo reprodutivo preparando seus gametas para desová-los de uma única vez, maximizando esse esforço com a deposição de milhões de ovos simultaneamente.
Situações ambientais diferentes fornecem sinais específicos que podem ser explorados para predizer o tempo em que a reprodução tem mais probabilidade de sucesso. Em ambientes previsivelmente inóspitos como extremas latitudes e altitudes, fotoperíodo e temperatura são sinais confiáveis associados com a previsão de condições de primavera ou semelhantes ao verão. Enquanto que os ambientes tropicais não sofrem extremos sazonais em fotoperíodo e temperatura, frequentemente existem períodos de seca e umidade regularmente repetidos. É por isso que temos períodos de reprodução razoavelmente definidos, variáveis conforme a região. Assim, o timing da reprodução em peixes pode ser influenciado por vários fatores, incluindo temperatura, fotoperíodo, salinidade, conteúdo iônico da água, fluxo da água, abundância de alimento, disponibilidade de local para nidificar e condições sociais.
Peixes de zona temperada reproduzem em resposta a dias curtos e temperaturas frias (por exemplo, trutas, salmões) e outros a dias longos e temperaturas quentes (por exemplo, carpas, peixes de piracema). Entretanto, a temperatura pode atuar como um sinal independente do fotoperíodo.
Mais comumente, peixes tropicais e subtropicais podem exibir reprodução sazonal em associação com o estabelecimento da estação das chuvas, que está correlacionado com a disponibilidade de alimento, assim como ao habitat.
Em muitas espécies, a maturação gonadal frequentemente precede o estabelecimento da estação das chuvas, possivelmente em resposta à crescente concentração iônica das águas que estão secando. Em espécies tropicais pode ser encontrada reprodução durante todo o ano, embora exista um pico de reprodução em associação com a estação chuvosa. Como um corolário, pode-se afirmar que a reprodução é um processo que só deve ocorrer naturalmente em circunstâncias favoráveis para a prole e para os reprodutores.
Os estímulos ambientais são captados pelos peixes através de seus órgãos sensoriais. Sistemas sensoriais e áreas especificas do cérebro servem para integrar eventos internos e externos, que resultam em alterações no sistema reprodutivo. O estímulo pode ser enviado, por exemplo, através dos olhos, sistemas olfatório, vomeronasal ou auditivo, com inputs a núcleos cerebrais específicos.
Para compreender o input da informação para o sistema neurohormonal, e como o cérebro pode integrar o output neurohormonal, para regular a atividade reprodutiva, é preciso conhecer como os vários órgãos atuam como uma unidade: são os elementos do sistema hipotálamo-hipófise-gônadas (ovários e testículos). O hipotálamo é uma região específica do cérebro que, entre outros neurohormônios, secreta o hormônio liberador de gonadotropinas - GnRH, e a dopamina, que têm influencia na liberação de gonadotropinas - GtHs da hipófise.
A hipófise é uma glândula que produz vários hormônios, entre eles as gonadotropinas, responsáveis pelo controle da reprodução. Essas gonadotropinas vão atuar sobre as gônadas, promovendo a liberação de hormônios esteróides, estes com atuação na maturação dos gametas, tanto durante o ciclo reprodutivo quanto nas fases finais de maturação e ovulação. Os esteróides retornam ao hipotálamo e hipófise via corrente sanguínea, para modular as funções subsequentes desses órgãos. A desova - ou seja, expulsão dos gametas - é mediada também pelas prostaglandinas, principalmente a Prostaglandina F2a.
Diferente do que acontece com mamíferos, onde o embrião é nutrido através da mãe, o embrião da maioria dos peixes realiza o seu desenvolvimento às expensas da reserva acumulada no ovo, sob a forma de compostos de lipofosfoglicoproteínas chamados genericamente de vitelo. Na maioria dos ovócitos de vertebrados, o vitelo não é sintetizado in situ, mas sim derivado de uma proteína precursora conhecida como vitelogenina, sintetizada no fígado do animal.
Durante o desenvolvimento ovariano, a Gonadotropina I produzida pela hipófise, é levada pela corrente sanguínea até o ovário, que produz o estrógeno Estradiol 17b e o lança novamente na corrente sanguínea para ser transportado até o fígado. Aqui, o estradiol estimula a produção de um precursor do vitelo (gema) do ovo, a vitelogenina, que volta para o ovário e é incorporado pelo ovócito em crescimento. Quando a vitelogênese (deposição de vitelo) se completa, a hipófise reduz a produção de gonadotropina I e aumenta a secreção de gonadotropina II. Sob ação desta gonadotropina, a produção de esteróide pelo ovário muda de estrógenos para progestinas (por ex. 17a20bhidroxiprogesterona), e o ovócito, então vitelogênico, morfologicamente pronto mas fisiologicamente incapacitado para ser ovulado, sofre a maturação final (migração e quebra do núcleo ou vesícula germinal) e está pronto para ser ovulado. Durante o desenvolvimento testicular, que também está sob o controle das gonadotropinas, os andrógenos (por ex. 11 ketotestosterona) estão envolvidos no processo de espermatogênese e progestinas (por ex. 17a20bhidroxiprogesterona), também estão envolvidas na produção do esperma maduro.
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| Figura 2: a reprodução nos peixes é controlada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas . |
A importância prática de saber sobre o processo vitelogênico tem implicação em vários aspectos. O primeiro deles diz respeito à alimentação adequada da fêmea - uma vez que a reserva do embrião é dada através do vitelo acumulado no ovócito, um animal com deficiência nutricional vai priorizar a sua própria manutenção e destinar para incorporação no ovócito apenas parte do que seria necessário para o bom desenvolvimento posterior do embrião. Consequentemente, vai resultar em larvas frágeis, com mortalidade elevada. Em outras palavras, isto significa que devemos alimentar adequadamente o animal muito antes do início do período reprodutivo, momento em que o processo de vitelogênese já está na sua fase final ou mesmo completo.
Outro aspecto importante é o momento adequado para injetar o hormônio - se o ovócito não estiver numa determinada fase avançada da maturação, não irá produzir os esteróides necessários para a maturação final e ovulação.
Em peixes de piracema, na ausência de estímulo hormonal exógeno, o desenvolvimento do ovócito não se continua além da fase vitelogênica. falta-lhe um “gatilho” hormonal para que continue o seu desenvolvimento, e é isso que se fornece ao animal quando se administra as preparações hormonais de indução artificial da reprodução.
Uma vez ovulados, os óvulos de diferentes espécies permanecem férteis dentro do ovário ou da cavidade do corpo por períodos que variam de uma hora a vários dias. Depois desse tempo, os óvulos tornam-se “supermaduros” e começam a se desintegrar. Esta característica deve ser bem entendida, para ser otimizada em casos de reprodução induzida. Em um peixe onde os óvulos permanecem férteis apenas por um breve período (carpas, pacus, etc. são um bom exemplo) a desova ou extrusão deve acontecer rapidamente. Idealmente, a injeção dos hormônios deve ser cronometrada para produzir ovulação em uma hora conveniente do dia. Ovulação e supermaturação dos óvulos mantidos na cavidade do corpo são altamente dependentes da temperatura.
Depois que a desova termina, os oócitos vitelogênicos remanescentes são reabsorvidos, num processo conhecido como regressão gonadal. Isso também acontece finalmente em peixes maduros que não encontram as condições adequadas para a maturação final e desova.
A maturação final e a ovulação são os estágios de reprodução mais comumente induzidos na terapia hormonal. Uma variedade de protocolos são efetivos, inclusive manipulação ambiental em algumas espécies.
Objetivos da indução artificial da maturação e ovulação em peixes
A prática mais usual da utilização de hormônios na reprodução induzida de peixes no Brasil, está mais relacionada à desova de peixes de piracema, mas esse é apenas um dos objetivos possíveis da manipulação hormonal com fins reprodutivos. Os hormônios ou preparações hormonais podem ser utilizados para adiantar o período de desova em uma população, por exemplo. Um período antecipado de reprodução permite aos produtores maior flexibilidade na comercialização de larvas e alevinos. Além disso, pode-se restringir a desova a um certo período, também, para maximizar tempo e recursos, permitir maior rendimento e rotatividade dos viveiros de alevinagem. Podem ser utilizados também para sincronizar a desova de machos e fêmeas e aumentar a produção de sêmen, que é crítico em algumas espécies. Pode-se, ainda, com a ação combinada de manejo ambiental, ampliar os períodos em que os animais estão aptos para a reprodução. São infinitas as aplicações, existindo inúmeras técnicas e várias preparações hormonais disponíveis no mercado.
Tipos de hormônios utilizados na indução artificial da reprodução em peixes
Como já foi visto, a reprodução nos peixes é controlada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (Fig.2). Esse mecanismo sequencial permite intervenções em vários níveis, para promover ou interferir no processo de maturação, com o uso de compostos específicos.
- Ao nível hipotalâmico a intervenção seria possível com o uso de antiestrógenos (compostos sintéticos capazes de competir com estrógenos por sítios de ligação, nos receptores de estrógenos) que impediriam os hormônios de se ligar aos receptores e eliminariam o feedback negativo dos esteróides sobre a produção de gonadotropinas;
- Ao nível hipofisário, o uso de GnRHs e seus análogos estimulariam a produção e liberação de gonadotropinas pelas células gonadotrópicas hipofisárias; por sua vez, o uso de antagonistas de dopamina também é eficaz em várias espécies. A dopamina inibe a secreção de gonadotropinas, e substâncias que eliminem essa inibição resultariam no aumento dos níveis plasmáticos de gonadotropinas;
- Ao nível gonadal, o uso de preparações de extratos hipofisários e de gonadotropinas forneceriam as gonadotropinas, necessárias para a maturação final do oócito em fêmeas e espermiação nos machos. Por outro lado, progestinas e corticosteróides também atuariam ao nível do folículo do ovócito para esse fim. Ainda no ovário, a ação de prostaglandinas e catecolaminas são importantes para a ovulação.
O uso de antiestrógenos, progestinas, corticosteróides e prostaglandinas é mais utilizado em pesquisas; na prática da reprodução artificial em piscicultura, os mais utilizados são os hormônios liberadores de gonadotropinas, os antagonistas de dopamina e os hormônios hipofisários, e cada um deles será visto a seguir.
Hormônios Liberadores de Gonadotropinas - GnRHs
No nível da hipófise (Figura 2), a intervenção poderia ser feita com a utilização de neuropeptídeos produzidos no hipotálamo e locais específicos no cérebro.
A descoberta de que a produção e a liberação de gonadotropinas é regulada em mamíferos por um peptídio originado do hipotálamo abriu uma nova via de pesquisa no controle da ovulação em peixes. O decapeptídeo - LHRH foi primeiro isolado e caracterizado no hipotálamo de porcos e ovinos em 1971. A sequência de aminoácidos desse GnRH de mamífero logo foi determinada, e logo se tornou evidente que ele não tinha espécie-especificidade. Em 1975 apareceu o primeiro trabalho com o uso de LHRH para cinco espécies de peixes cultivados na China. Estudos posteriores demonstraram que o LHRH poderia ser usado tanto para estimular o desenvolvimento ovariano quanto para induzir a ovulação.
Antes de tratar sobre o GnRH e seus análogos, cabe um esclarecimento sobre a sua terminologia. Os termos GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) e LHRH (Luteinizing-hormone Releasing Hormone) são com frequência usados indistintamente, mas, estritamente falando, o termo LHRH refere-se apenas a um certo tipo de GnRH - o que libera o hormônio LH (Luteinizing Hormone ou H. Luteinizante).
As gonadotropinas produzidas pelos peixes não são as mesmas do hormônio luteinizante de mamífero, embora uma delas seja, até o momento, descrita como LH-like (semelhante ao LH). GnRH é o termo genérico, e nós devemos falar de GnRH de mamífero, de ave, GnRH de peixe etc. Quando se discute o uso dos hormônios liberadores de gonadotropinas em piscicultura, se necessita de ambos os termos, porque muitos dos hormônios são de fato análogos do LHRH de mamíferos, e algumas pessoas ainda usam o termo antigo.
Nosso conhecimento da estrutura e função do GnRH em peixes tem aumentado bastante na última década. Como o de mamíferos, o GnRH de peixes é um pequeno peptídio, com 10 aminoácidos, cuja estrutura já foi determinada em várias espécies. Apenas o GnRH de mamífero - e análogos - e de salmão são usados normalmente na indução de rotina da reprodução de peixes.
A molécula do GnRH de peixes (salmão) é 80% idêntica a do LHRH de mamífero, e essa similaridade tem permitido a utilização do LHRH em piscicultura.
Sabe-se atualmente que o cérebro de peixes pode conter não apenas um, mas dois ou mais GnRHs diferentes; entretanto, pesquisas mais aprofundadas ainda estão sendo feitas para determinar as funções das formas diferentes.
Como o GnRH é uma molécula pequena (10 aminoácidos) pode ser facilmente sintetizada, e disponibilizada no mercado a preços acessíveis. A manipulação desses aminoácidos e a substituição de alguns deles em determinadas posições resultou em análogos superativos (chamados comumente de LHRHa, ou análogo). A explicação para o aumento da potência dos análogos veio através de experimentos, que demonstraram que a mudança em determinadas posições alteravam a conformação da molécula e melhoravam a sua ligação com o receptor, permitindo que o GnRH permanecesse mais tempo ligado, reduzindo a sua taxa de degradação enzimática e permitindo que os aumentos de gonadotropinas plasmáticas dependentes de GnRH permanecessem por mais tempo.
Um dos análogos mais populares de GnRH para indução de desova em piscicultura é um análogo do GnRH de mamífero (LHRH), modificado pela substituição por uma D alanina na posição 6 e a retirada do décimo aminoácido, a glycina, esta substituída por uma etilamida. É o chamado LHRHa , (ou (DAla6,des-Gly 10) LHRH etilamida ou (-Ala6-Pro9-Net) mGnRH.
Existem vários análogos de GnRH disponíveis no mercado, mas os mais utilizados são o LHRHa e o sGnRH (GnRH de salmão). O LHRHa normalmente é comercializado sob a forma de cristais brancos, solúveis em água, em frascos ou ampolas com 1 mg, ou mais (5 ou 10 mg). Deve ser estocado sob refrigeração e ao abrigo da luz solar direta para prolongar seu tempo de utilização. As doses são usualmente preparadas dissolvendo-se os cristais em solução salina 0,7%. É comum haver a necessidade de diluir todo o frasco ou ampola e utilizar apenas uma parte. Nesse caso, o hormônio deve ser diluído em água destilada estéril e separado em alíquotas de dosagem conhecida, que serão guardadas em frascos individuais (normalmente do tipo Eppendorf), etiquetadas e congeladas até utilização. Deve-se evitar o descongelamento/congelamento do hormônio.
A dose normalmente utilizada está em torno de 10-15 mg/kg para fêmeas e 3-5mg/kg para machos, em uma única aplicação. É importante mencionar que as dosagens irão depender fundamentalmente da espécie e do estado de maturação do reprodutor, e que só estão sendo apresentadas como referência.
A manipulação de GnRHs ou análogos deve ser feita com bastante critério, pois são drogas potentes e sua ação em humanos é similar à esperada em peixes - estimulação de gonadotropinas e liberação de hormônios sexuais - com a importante diferença que a administração crônica em humanos conduz a um decréscimo na liberação de gonadotropinas e, portanto, de esteróides sexuais.
É lógico que há uma possibilidade remota de que piscicultores possam receber uma dose razoável sustentada, mas, mesmo assim, deve ser evitado o contato e a inalação da droga. GnRHs não devem ser manipulados por mulheres grávidas e peixes tratados com a droga não devem ser comidos.
Vantagens/Desvantagens do uso de GnRH
Os hormônios liberadores têm três grandes vantagens sobre as gonadotropinas para a indução da maturação e desova. As duas primeiras são biológicas: eles atuam no início da cadeia hormonal e fazem com que o peixe produza a sua própria gonadotropina, portanto eliminando todos os problemas causados pelo uso de gonadotropinas de uma outra espécie (como no extrato hipofisário de doadores heterólogos). Segundo, a molécula de GnRH por si mesma não é altamente espécie-específica. Terceiro, elas são simples, facilmente fabricadas, moléculas estáveis cuja atividade biológica não varia de lote a lote e, porque são ativas em concentrações muito baixas, seu uso é econômico.
As desvantagens mais referidas é que são preparações que precisam ser pesadas em quantidades mínimas, da ordem de microgramas, o que só se obtém com balança de precisão. Portanto, seu uso em condições de campo é restrito. Além disso, normalmente vêm em apresentações de dosagens elevadas, que precisam ser diluídas a quantidades normalmente maiores que as necessárias, ocasionando perdas. A validade da atividade das alíquotas diluídas, mesmo congeladas, não está ainda estabelecida com precisão.
Os trabalhos iniciais com GnRH ou GnRHa na reprodução induzida incluíram muitos sucessos fantásticos e muitas falhas também, e apenas nos últimos anos é que métodos mais confiáveis para muitas espécies começaram a aparecer. Para muitas espécies, o GnRH é altamente efetivo por si mesmo; para outras, particularmente carpas, é muito mais efetivo quando suplementado com antagonistas de dopamina.
Apesar das desvantagens, o GnRHs e análogos, associados ou não a outras preparações, são atualmente as drogas mais promissoras para uso na reprodução induzida de peixes.
Antagonistas de Dopamina
No começo da década de 80, foi demonstrado que a secreção de gonadotropina em Carassius auratus era regulada por um sistema neuro-hormonal duplo: GnRH estimula e dopamina inibe. Muitos experimentos utilizando a supressão dessa inibição foram a seguir experimentados. Não se sabe se a gonadotropina é regulada por esse mecanismo on-off (liga-desliga) em todos os peixes, e a inibição de dopamina pode ser fraca ou mesmo inexistente em algumas espécies, como algumas pesquisas recentes têm demonstrado.
A inibição da dopamina pode ser bloqueada através da injeção de drogas que liguem-se especificamente a receptores de dopamina, ou uma tipo a reserpina, que em geral depleta todas as catecolaminas (uma das quais é a dopamina). A ação da reserpina é muito geral e a droga tem tantos efeitos colaterais que seu uso é desaconselhado. Os dois antagonistas de dopamina mais específicos e mais utilizados são a domperidona e a pimozida. A domperidona é mais barata e mais potente que a pimozida e tem a vantagem de não cruzar a barreira sangue-cérebro, sendo a mais recomendada atualmente.
Vantagens/Desvantagens do uso de antagonistas de dopamina
A principal vantagem da utilização de antagonistas de dopamina está no efeito sinérgico e potencializador do GnRH, consequentemente aumentando as taxas de produção/ liberação de gonadotropinas na corrente sanguínea. Como desvantagem, pode-se referir a mesma questão do uso de dosagens mínimas, como para o GnRH, e o desconhecimento de sua eficácia em várias espécies, tanto pela possibilidade (ou não) de inibição dopaminérgica quanto pela determinação das doses adequadas, entre outros fatores.
Ultimamente, algumas técnicas têm sido mais utilizadas, como o caso da aplicação dos análogos de GnRH em combinação com um antagonista de dopamina (método LINPE - deve-se a Lin e Peter, pesquisadores que começaram a trabalhar com essa metodologia). Esse método tem sido bastante eficaz quando o GnRH sozinho não apresenta bons resultados. Tem sido usado principalmente em carpas, mas também tem sido testado em espécies nativas brasileiras.
A dose normalmente utilizada, associada ao LHRHa, está em torno de 5mg/kg, aplicadas simultaneamente ao GnRH, igualmente em dose única.
Já se encontram disponíveis no mercado preparações comerciais combinando análogos de GnRH (LHRHa (de mamífero) e sGnRHa (de salmão)) e domperidona num só produto, com apresentações sólida e líquida. As apresentações sólidas podem ser encontradas sob a forma de pellets para implantes ou glóbulos, semelhantes à hipófises desidratadas. A dosagem injetável usual da apresentação sólida (LHRHa+Dom) é de 3,5 mg/kg de peixe, e o preparo da dose é semelhante ao de hipófises: maceração, diluição em salina e injeção, normalmente em dose única. A dose da apresentação líquida (sGnRHa + Dom) é de 1,0 ml/Kg.
Mais uma vez, vale lembrar que essas dose são apenas referência, e deve ser mantido todo o cuidado na manipulação e armazenagem do hormônio.
Gonadotropinas (GtHs)
Continuando na sequência dos níveis de intervenção, temos a ação direta das gonadotropinas sobre as gônadas (Fig.2).
As gonadotropinas são hormônios glicoprotéicos de origem placentária ou hipofisária, que estimulam o desenvolvimento e função gonadal. As GtHs usadas para a ovulação induzida de peixes caem em duas categorias, conforme se originem de peixes ou de mamíferos. GtHs de mamíferos, por sua vez, também podem ser separadas, conforme sejam de origem hipofisária (LH - Hormônio Luteinizante, FSH - Hormônio Folículo-Estimulante) ou de origem placentária (HCG - Gonadotropina Coriônica) ou PMSG (gonadotropina sérica de égua prenhe).
Do ponto de vista prático, as preparações de gonadotropinas de peixes podem ser subdivididas conforme seu grau de purificação. Essas preparações variam desde extratos aquosos de hipófises inteiras, usadas nos procedimentos comuns de hipofisação (ou através de pós de hipófises secas em acetona), até GtHs parcialmente purificadas, preparadas por filtração em gel, com ou sem cromatografia de troca iônica, ou por cromatografia de afinidade em concanavalina-A-sepharose.
Extrato de hipófises de peixes
A hipofisação é um processo bastante conhecido, praticado desde a década de 30, e é uma simples terapia de substituição, ou seja, a gonadotropina de um peixe é administrada em outro que não está produzindo o suficiente por si mesmo, e desencadeia os passos da sequência hormonal, levando à maturação final/ovulação. É a técnica de indução mais utilizada. Pode ser efetuada a partir de hipófises frescas ou dessecadas em acetona.
Vantagens/desvantagens do uso do extrato hipofisário
São muitas as vantagens e desvantagens desta técnica. Entre as vantagens, podemos citar a sua simplicidade, que não necessita muitas instalações ou equipamentos; não é necessário estocagem refrigerada; a dosagem pode ser facilmente calculada baseando-se na relação entre o peso do doador e o do receptor ou contando-se o número de glândulas por peso de receptor; outros hormônios presentes no extrato podem ter um efeito sinérgico à gonadotropina. Entre as desvantagens, a principal delas é a ausência de padronização de potência - uma glândula certamente tem uma quantidade diferente de hormônios de outra de mesmo peso; há necessidade de uma espécie doadora, em fase reprodutiva correspondente a um nível de gonadotropina, suficiente para induzir a reprodução na espécie receptora (em termos práticos, isto significa que a hipófise para ser utilizada na indução da reprodução não pode ser coletada em qualquer tempo, mas sim quando tiver armazenado hormônio o suficiente - normalmente na pré-desova). Há referências de que o peixe pode desenvolver uma reação imune a GtH ou outras proteínas do extrato com o tempo, especialmente no caso de hipófises heteroplásticas. Uma outra possibilidade referida na literatura é que o uso de hipófises frescas permite a transmissão de doenças do doador para o receptor.
A injeção de extrato hipofisário é o método mais comum no Brasil, normalmente com resultados positivos na maioria das espécies. As doses médias utilizadas são de 5,5mg/kg para fêmeas, aplicadas em duas doses, com 12 horas de intervalo (sendo 10% do total na dose inicial e o restante na dose decisiva) e 2-3mg/kg para machos, em dose única, por ocasião da segunda dose das fêmeas. As apresentações comerciais são usualmente em glândulas ou pó de glândulas trituradas, em frascos de 1 g.
Preparações de gonadotropinas de peixe purificadas
Desde os anos 70, preparações purificadas e semipurificadas de gonadotropinas de peixes têm sido produzidas, e tem uma especificidade maior que as preparações de hipófises inteiras. Entretanto, essas preparações são mais adequadas para pesquisa e estudos de desenvolvimento do que para aplicação direta em piscicultura. Elas têm sido preparadas de hipófises de poucas espécies, usando uma combinação de métodos de extração e cromatografia. Até agora, a maioria dessas gonadotropinas têm sido produzidas em quantidades muito pequenas, e isso tem restringido o seu uso, embora uma exceção seja a gonadotropina semipurificada de salmão do pacífico, a SG-G100, que tem sido produzida comercialmente.
Vantagens e desvantagens das gonadotropinas purificadas e semi-purificadas
Como vantagem, pode-se mencionar que são mais ou menos livres de outros hormônios hipofisários; podem ser padronizadas em ensaios in vivo e in vitro, ou radioimunoensaio; podem ser estocadas por muitos anos e facilmente solúveis em água ou solução salina sem resíduos. Como desvantagem, a não disponibilidade fácil no mercado e a pouca experiência do seu uso na rotina de piscicultura. São mais utilizadas em pesquisa.
Gonadotropinas de mamíferos - Das gonadotropinas placentárias de mamíferos, a mais utilizada é o HCG. Das duas gonadotropinas hipofisárias de mamíferos (FSH e LH), apenas o LH foi demonstrado como indutor eficaz da ovulação em peixes, mas não oferece vantagens sobre o HCG. O HCG (Gonadotropina Coriônica Humana) é uma glicoproteína de peso molecular de 38,600 Daltons, secretada pela placenta humana. Consiste de duas subunidades: alfa, que contem 92 aminoácidos, e beta, que contém 145 aminoácidos. Além disso, tem um componente de 33% de carboidrato. O HCG é obtido através da purificação da urina de mulheres grávidas. Farmacologicamente, o HCG funciona de maneira semelhante ao LH. O HCG tem sido utilizado em muitas espécies nativas, sozinho ou em combinação com extrato hipofisário, tanto em machos quanto em fêmeas. É normalmente diluído em água destilada ou salina, e injetado intra muscular ou intra peritonial. Sua atividade é medida em Unidades Internacionais (UI). HCG puro contém aproximadamente 10.000 UI/mg, enquanto que o HCG preparado para uso médico ou veterinário contém 2000-3000 UI ou menos. Fornecedores de hormônios para piscicultura normalmente vendem HCG em frascos que contêm 10.000 UI. A dose mais comum utilizada em várias espécies de peixes para indução da reprodução é de 1000 UI/kg, em injeção única ou em duas. A literatura refere que preparações que contêm mistura de GtHs hipofisárias e placentárias têm sido usadas com sucesso, tanto sozinhas quanto junto com extrato hipofisário, mas não temos conhecimento de sua utilização no Brasil.
Vantagens e desvantagens do uso de gonadotropinas placentárias e hipofisárias
Entre as vantagens que poderíamos relacionar, estão a sua facilidade de aquisição no mercado, a possibilidade de estocagem por longos períodos, sua uniformidade e padronização. Por outro lado, eliminam a necessidade de sacrificar peixes doadores, e eliminam os procedimentos de coleta e preservação de hipófises. A principal desvantagem do seu uso é a grande diferença filogenética com a gonadotropina de peixes, que faz com que sejam necessárias dosagens elevadas e mesmo muitos animais não respondem positivamente seu uso. Há referências de que seu uso repetido pode levar os peixes a tornarem-se refratários, como resultado de resposta imune. Do ponto de vista da economicidade, é um dos hormônios de custo mais elevado para a indução.
Hormônios Esteróides
Já é bastante conhecido que as ações de gonadotropinas ao nível ovariano são mediadas através de esteróides, e alguns estudos para a indução da ovulação em peixes têm sido realizados. Deles, estrógenos e andrógenos não têm sido muito eficazes e corticosteróides apresentaram eficácia com algumas espécies em nível experimental. Derivados de progesterona têm reconhecida ação na maturação final e ovulação em peixes. Estas preparações podem ser utilizadas para induzir a maturação final, entretanto a ovulação somente irá ocorrer quando a concentração de gonadotropina endógena for suficiente, ou quando um mínimo de gonadotropina exógena é fornecida. Ou seja, poderiam substituir parcialmente a gonadotropina, ou complementar sua ação em animais pré-injetados. Esses resultados têm aparecido mais experimentalmente, desconhecendo-se o seu uso na rotina de piscicultura.
Escolha do hormônio
O sucesso na indução da reprodução em peixes não está apenas no hormônio adequado, mas, principalmente, na qualidade do reprodutor. Apesar de simples, esta afirmativa envolve inúmeros aspectos intrínsecos e extrínsecos ao animal, como o ambiente, a carga de estocagem, a alimentação, o manejo, a origem, a idade, o estado de maturação, etc. Pela complexidade dos sistemas fisiológicos, infere-se a interligação de cada um desses fatores - além de outros - para que o animal esteja no seu conforto fisiológico ideal para sofrer uma intervenção com sucesso. A rotina das pisciculturas normalmente leva a os produtores a tratar com pouca diferença reprodutores e animais de corte. Basta comparar como se trata normalmente um cavalo ou touro reprodutor e um peixe reprodutor. Como respostas a esse tratamento, não raro encontramos baixas taxas de fertilização, eclosão, sobrevivência na alevinagem, além de morte dos reprodutores e respostas medíocres à indução.
O estresse dos animais - crônico ou agudo - é um inimigo que deve ser evitado a qualquer custo, acondicionando e transportando animais adequadamente, utilizando anestésicos para o manejo, etc., pois é um fator importantíssimo na baixa performance de animais manejados. Considerando que temos todos esses fatores sob controle, a escolha do hormônio é mais uma questão de conhecimento da espécie que estamos trabalhando, da nossa experiência, da adequação da preparação aos resultados que esperamos e o custo/benefício que iremos obter nesse processo.
Algumas espécies respondem melhor a uma ou outra preparação, e o piscicultor deve testar sempre os novos produtos que chegam ao mercado, embora seja mais confortável trabalhar com aquele mesmo hormônio que sempre foi utilizado. Deve também procurar partilhar experiências e testar mais de uma vez. Os resultados podem ser surpreendentes. A resposta positiva de uma determinada preparação não está apenas na ocorrência da desova, mas sim em toda uma sequência de análises que não termina na venda dos alevinos e no rendimento alevinos/ kg de fêmea, mas se estende pelo tempo em que esse reprodutor permanece ativo, com bom rendimento.
Se for tomado individualmente, o custo/kg de fêmea não é elevado, à luz dos milhares de alevinos que podem resultar; entretanto, quando se considera o trabalho em lotes, uma taxa média de resposta positiva de 80%, o tamanho dos reprodutores, as perdas com mortalidade na larvicultura e alevinagem etc., esse valor pode ser significativo. Por exemplo, um tambaqui de 10 kg induzido com hipófise custaria R$ 27,50 e com LHRHa R$ 15,00 (54,5 % menos) sendo que o animal responde satisfatoriamente a ambos. Um outro fator que não deve ser esquecido é que os preços desse hormônios normalmente são em dólar americano ou canadense, atualmente quase o dobro da moeda brasileira.
Novas tendências
O sucesso que vem sendo obtido com a utilização de análogos de GnRH, associados ou não a bloqueadores dopaminérgicos (com a crescente redução de custos à medida que novos fabricantes entram no mercado), leva a crer que esta metodologia será cada vez mais utilizada.
Outros hormônios também estão sendo testados experimentalmente, como por exemplo os hormônios tireoidianos, e outras preparações, como extrato preparado a partir de hipófise de aves. Esta metodologia, realizada experimentalmente pela Universidade Federal Fluminense e o CEPTA/IBAMA, utilizou hipófises retiradas de frangos de corte (41 dias), dessecadas em acetona conforme prática usual para hipófises de peixes. As doses totais utilizadas nos animais experimentais (pacu, e curimbatá) variaram de 5 a 10 mg/kg, em duas aplicações, com intervalos de 10 a 12 horas, e tiveram sucesso semelhante ao extrato hipofisário de peixe na reprodução dessas espécies.
Novas descobertas têm sido feitas quando a ação/modulação de novos neurohormônios (Neuropeptídio Y, GABA p.ex.) nos processos neuroendócrinos relacionados à reprodução, e é provável que sejam identificadas novas substâncias ou compostos com aplicação na prática de indução à reprodução de peixes. Por outro lado, muitas combinações entre os hormônios usuais têm sido testadas e estão ainda em teste, com uma variedade enorme de protocolos, dosagens, intervalo entre dosagens, aplicações únicas, fracionadas etc. Métodos de liberação lenta (soluções viscosas, implantes de hormônio ligado a uma matriz de colesterol, colesterol + celulose, bombas miniosmóticas, matrizes de polímeros), administração oral de hormônios, etc., são alternativas interessantes e ainda pouco trabalhadas no Brasil.
